實驗微生物接種技術(shù)講解

　　微生物包括：細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個體微小，與人類關(guān)系密切。以下是小編為大家整理的實驗微生物接種技術(shù)講解，僅供參考，希望能夠幫助大家。

　　實驗微生物接種技術(shù)講解1

　　一、目的：

　　學(xué)習(xí)微生物工作的基本接種方法，建立純培養(yǎng)技術(shù)中的“無菌”概念，掌握無菌操作技術(shù)。

　　二、原理：

　　所謂接種就是將一定量的純種微生物在無菌操作條件下轉(zhuǎn)移到另一已滅菌，并適宜于該菌生長繁殖所需的培養(yǎng)基上的過程。本實驗要求嚴格進行無菌操作，一般是在無菌操作臺或在實驗室內(nèi)火焰旁進行。根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮团囵B(yǎng)方式，可以采用不同的接種工具和接種方法。

　　三、實驗材料：

　　斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基、記號筆、酒精燈、接種針、消毒酒精、涂布棒等。

　　四、操作步驟

　�。ㄒ唬�無菌操作

　　菌種分離或移接工作應(yīng)在無菌環(huán)境中進行，接種室、接種箱或超凈工作臺是常用的'接種環(huán)境。用前先清潔好衛(wèi)生，再進行消毒處理�？捎米贤饩�燈和甲醛熏蒸的雙重作用，或用3%來蘇爾及其他表面消毒進行噴霧。

　　操作者的手應(yīng)先用肥皂洗凈，再用酒精棉球消毒；整個操作過程都要靠近酒精燈火焰；接種工具在用前和用后必須在燈焰上滅菌；棉塞不得亂放，操作中只能夾在手上；不能有跑、跳等力度大的動作，以免引起空氣大振動而增加染菌機會。

　�。ǘ�）接種方法

　�。�1）斜面接種：

　　從已長好微生物的菌種管移接到另一斜面管的方法。此法用于好氣性微生物的接種。

　　左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平。用右手先將棉塞擰轉(zhuǎn)松動，再拿接種環(huán)，用右手的小指、無名指和手掌撥下棉塞并夾緊，同時將管口在火焰上燃燒一圈，接種環(huán)灼燒滅菌后插入管內(nèi)，冷卻、挑菌，立即轉(zhuǎn)入斜面管底部，沿斜面劃曲線或直線。

　　圖1.斜面接種示意圖

　�。�2）液體接種：

　　由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。

　　操作與上法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，再輕輕搖動均勻，即可培養(yǎng)。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時，一般用移液管或滴管接種。

　�。�3）穿刺接種：

　　用接種針挑取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厭氣性細菌接種、檢查細菌的運動能力。

　　（4）平板接種：

　　將菌種接至培養(yǎng)皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，活菌計數(shù)以及在平板上進行各種試驗時采用的一種接種方法，可分為下面幾種：

　　1)斜面接平板

　　a.劃線法：見平板劃線分離法。

　　b.點種法：一般用于觀察霉菌和酵母細胞，輕輕點在平板的表面（根霉點一點，曲霉、酵母可點3-4點）即可。

　　2)平板接斜面：一般是將經(jīng)平板分散培養(yǎng)得到的單菌落接種到斜面，以便作鑒定或擴大培養(yǎng)、保存之用。

　　五、思考題

　　1．何謂無菌操作？接種前應(yīng)作哪些準備工作？

　　2．總結(jié)幾種接種方法的要點及應(yīng)注意的事項？

　　實驗微生物接種技術(shù)講解2

　　實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)掌握無菌操作技術(shù)；學(xué)習(xí)接種方法；學(xué)習(xí)常用的分離、純化菌種的方法。實驗內(nèi)容：

　　一、接種

　　將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

　�。�、接種工具和方法

　　在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。（圖３－３）

　　1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

　　常用的接種方法有以下幾種：

　�。保﹦澗�接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

　�。玻┤�點接種在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進行接種的。

　�。常┐┐探臃N在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。

　�。矗�澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°

　　C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。

　�。担┩坎冀臃N與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。

　�。叮┮后w接種從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。

　�。罚┳⑸浣臃N該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。

　�。福┗铙w接種活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。

　　２、無菌操作

　　培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

　　實驗臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實驗室的門窗，并用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。

　　空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖３－４）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。

　　二、分離純化

　　含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。

　�。薄�傾注平板法

　　首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖３－５，a）

　　首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂�，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖３－５，b）３、平板劃線法

　　最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖３－６）當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落。（圖３－７）

　�。�、富集培養(yǎng)法

　　富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

　�。�、厭氧法

　　在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

　　三、培養(yǎng)

　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。

　�。�、影響微生物生長的因素

　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。

　　1)營養(yǎng)物濃度

　　細菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān):μ=μmax*C/(K+C)營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。

　　K值是細菌生長的很基本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，表明細菌所需要的營養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養(yǎng)太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加，生長率愈接近最大值。

　�。玻�溫度

　　在一定的.溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內(nèi)，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至?xí)�死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10℃－20℃之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃－45℃之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃以上。

　�。常┧�分

　　水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當?shù)乃�分活性區(qū)域。

　�。矗┭鯕�

　　按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。a.需氧微生物

　　這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于這個類型。b.兼性需氧微生物

　　這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c.微量需氧微生物

　　這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物

　　這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。c.厭氧微生物

　　這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。

　�。病⑴囵B(yǎng)方法

　　1）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。

　　好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。

　　厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。

　　b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。

　　c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。

　　d.替代驅(qū)氧用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮氣驅(qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。

　�。玻└鶕�(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。

　　固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進行微生物培養(yǎng)的方法。

　　液體培養(yǎng)：在實驗中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

　　實驗微生物接種技術(shù)講解3

　　一、實驗原理

　　微生物接種就是在無菌條件下，用接種工具（針、環(huán)）從一支原菌種中挑取少許菌體，接入到另一支新的培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)的技術(shù)。

　　要想得到大量的菌種，適應(yīng)生產(chǎn)、科研和教學(xué)要求，就要進行微生物的接種，擴大菌種數(shù)量。接種因使用不同容器、不同的培養(yǎng)基，達到不同的目的，而有不同的接種方法，但它們的基本要求是相同的。通常接種都應(yīng)在空氣經(jīng)過消毒滅菌的接種室或接種箱或超凈工作臺內(nèi)完成。

　　二、實驗步驟

　　1.斜面接種

　�。�1）左手夾住試管

　�。�2）灼燒接種環(huán)

　�。�3）拔出棉塞，夾在小指、無名指上，管口過火

　�。�4）取菌、接種，接種后在火焰上方迅速塞好棉塞

　　（5）寫好標簽（菌種名、日期、接種者姓名），貼于斜面正上方前端約1cm處.

　�。�6）于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。（全班統(tǒng)一裝入一保鮮袋）

　　（7）一星期后觀察分離效果，拍照，分析結(jié)果

　　2.平板培養(yǎng)基（平板）制備

　�。�1）將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

　�。�2）右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。

　　（3）用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約10到20ml）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

　�。�4）等待平板冷卻凝固。

　　3.涂布平板法（以小組為單位，對混合菌菌懸液進行涂布分離）

　　(1)用75%酒精或0.01%新潔而滅擦洗雙手,進行消毒處理。

　�。�2）將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。

　　(3)取少量菌液滴加到培養(yǎng)基表面。

　　（4）將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8~10s。

　�。�5）用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面，涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻。

　　（6）將接種好的平板在皿底做好標記。

　�。�7）涂布分離的平板全班一起放入保鮮袋中，37度培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h。

　�。�8）一星期后以小組為單位觀察分離效果，拍照，分析結(jié)果4.劃線分離：從污染平板中純化細菌菌落（每人1個平板）

　　(1)用75%酒精或0.01%新潔而滅擦洗雙手,進行消毒處理。

　　（2）將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿接種環(huán)，在火焰上灼燒，待冷卻后用接種環(huán)在長有混合菌落的平板上挑取少量菌種，用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，劃線，其他每區(qū)劃線之前一定要把殘余的.菌體燒掉；待接種環(huán)完全能卻后通過前1區(qū)劃線。（一般劃4個區(qū)）

　　(3)將接種好的平板在皿底做好標記。

　�。�4）劃線分離的平板全班一起放入保鮮袋中，37度培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h.

　�。�5）一星期后觀察分離效果，拍照，分析結(jié)果

　　三、實驗結(jié)果

　　1、斜面接種

　　實驗結(jié)果及分析：此次斜面接種無污染，菌體生長較旺盛，形成了較多的單菌落，分離效果較好，這與接種場所進行了嚴格的消毒處理以及接種操作在超凈工作臺上進行，接種前用75%酒精對雙手進行了消毒處理，接種工具、管、瓶口接種前后要通過灼燒滅菌，塞子不能脫手等因素都有關(guān)，有效地防止了雜菌的污染。菌體的生長情況跟培養(yǎng)溫度、濕度、pH都有關(guān)。但接種時沒有使接種面積達到最大，以至于沒有最充分地利用培養(yǎng)基，菌體沒有長滿培養(yǎng)基，還有接種時不小心劃破了培養(yǎng)基的表面，下次做斜面接種時要注意盡可能地使接種面積達到最大，最充分地利用培養(yǎng)基，還有就是要避免劃破培養(yǎng)基，力求做到操作規(guī)范、科學(xué)、準確。

　　2.涂布平板法

　　上圖為稀釋100倍的涂布平板法結(jié)果

　　上圖為稀釋1000倍的涂布平板法結(jié)果

　　上圖為稀釋10，000倍的涂布平板法結(jié)果

　　上圖為稀釋100，000倍的涂布平板法結(jié)果

　　實驗結(jié)果與分析：如上4幅圖所示，此次所用菌液中包含兩種菌，即大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌，其中菌落較大、數(shù)量較多的為蘇云金芽孢桿菌，而菌落較小、數(shù)量較少的為大腸桿菌，說明混合菌液中蘇云金芽孢桿菌的濃度較大。經(jīng)稀釋100倍的菌液所生長起來的菌落數(shù)量最多，單菌落數(shù)量也挺多，但所占的比例不大，特別是蘇云金芽孢桿菌大多數(shù)都連在了一起，分離效果不好。經(jīng)稀釋1000倍的菌液所生長起來的菌落數(shù)量較多，可以看到蘇云金芽孢桿菌依然連成片，有些大腸桿菌菌落生長在蘇云金芽孢桿菌菌落之上，就大腸桿菌而言，單菌落較多，分離效果較稀釋100倍的菌液好。經(jīng)稀釋10，000倍的菌液所生長起來的菌落數(shù)量較少，依然有部分蘇云金芽孢桿菌連成了片；大部分大腸桿菌菌落為單菌落，分離效果較好。經(jīng)稀釋10，000倍的菌液所生長起來的菌落數(shù)量最少，但蘇云金芽孢桿菌依然連成了片；雖然大腸桿菌的單菌落較少，但分離效果是四個濃度中最好的。綜上所述，在一定濃度范圍內(nèi)，稀釋倍數(shù)越大，分離效果越好。

　　3.平板劃線法

　　實驗微生物接種技術(shù)講解4

　　1、定義

　　是指在執(zhí)行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法；

　　無菌操作技術(shù)是微生物實驗的基本技術(shù)，是保證微生物實驗準確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。

　　2、內(nèi)容

　　無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：

　　1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；

　　2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。

　　3、無菌操作原則

　　1）在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時必須穿工作服、戴工作帽，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/p>

　　2）在操作前20～30分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼3次后使用。嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；

　　3）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；

　　4）接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

　　5）接種環(huán)或接種針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；

　　6）吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應(yīng)在超凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復(fù)用酒精燈燒。

　　無菌操作的環(huán)境要求

　　1、無菌室

　�。�1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間；

　�。�2）無菌室的消毒和防污染

　　每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時）；

　　每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的'方式進行消毒；

　　每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時），特殊情況下可增加熏蒸頻次。

　�。�3）無菌室使用要求

　�、贌o菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品；

　�、跓o菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

　�、厶幚砗徒臃N食品標本時，進入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。

　　2、超凈工作臺

　　超凈臺的使用與保養(yǎng)：

　�。�1）風(fēng)速穩(wěn)定，且符合要求；

　�。�2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；

　　（3）讓超凈臺預(yù)工作10－15分鐘；

　�。�4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。

　　3、無菌器材

　�。�1）滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；

　　（2）消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。

　�。�3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺、轉(zhuǎn)椅等物品；無菌操作臺上一般只允許擺放以下物品：酒精燈、打火機、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質(zhì)器等。

　　無菌操作原則

　　1、無菌接種操作

　　培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。

　　在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

　　2、微生物檢驗過程中的無菌操作要求

　�。�1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；

　�。�2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放；

　　（3）在正火焰上方操作；

　�。�4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；

　�。�5）在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應(yīng)輕、準；

　�。�6）不能用嘴直接吸吹吸管；

　�。�7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。

　　3、無菌操作技術(shù)詳細圖解

　�。�1）取菌技巧

　　（2）接種技巧

　�。�3）錯誤示范

　　微生物的接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)

　　實驗微生物接種技術(shù)講解5

　　1、接種定義

　　接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

　　2、接種工具

　　在實驗室中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

　　1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.玻璃涂棒 5.接種圈 6.接種鋤 7.小解剖刀

　　3、微生物檢驗常見接種方法

　　（1）劃線接種法

　　平板劃線分離法--分區(qū)劃線分離法

　�、儆媒臃N環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線，再在2、3……區(qū)依次劃線；

　　②每劃完一個區(qū)域，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域；

　�、勖恳粎^(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落；

　　④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。

　　（2）斜面接種法

　　主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的`單個菌落的移種，以及觀察細菌的某些培養(yǎng)特征。

　　以菌種移種為例，其接種方法是：

　�、偃∫痪�種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)；

　�、谟沂帜粗负褪持阜謩e旋松兩管棉塞�；鹧鏈缇�接種環(huán)；

　　③以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內(nèi)管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；

　�、軐⒁褱缇�的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端；

　�、萑〕鼋臃N環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；最后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好；

　�、拮龊脴俗R，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。

　�。�3）涂布接種法

　　涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學(xué)因素對微生物的抑殺效應(yīng)。

　　原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長出單菌落而達到分離的目的。

　�。�4）液體接種法（肉湯接種）

　�、偃缧泵娼臃N法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

　�、跍缇�接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以18~24小時培養(yǎng)后觀察生長特征。

　　肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項：

　　a.發(fā)育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；

　　b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；

　　c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；

　　d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；

　　e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無氣體。

　�。�5）穿刺接種法（半固體接種）

　　多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細菌的某些生化反應(yīng)。

　�、偃缧泵娼臃N法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

　�、谝詼缇�接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達近管底部（但不能完全刺到管底），接種針應(yīng)沿原路退出；

　�、劢�(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養(yǎng)基混濁表示細菌有動力。